Ви є тут

Використання MALDI-TOF мас-спектрометрії у ветеринарній мікології

Досліджено використання MALDI-TOF мас-спектрометрії для ідентифікації дріжджів та пліснявих грибів у кормах для тварин. Матеріалом для роботи були зразки кормів для тварин, що надходили для дослідження з різних регіонів України. Наявність дріжджів та пліснявих грибів визначали згідно з ДСТУ ISO 7954:2006. Для встановлення загальної заспореності кормів мікроміцетами проводили первинне виділення грибів із кормів шляхом посіву їх на середовище Сабуро, при цьому застосовували метод серійних розведень для підрахунку вмісту діаспор грибів в 1 г корму. Інкубували досліджені зразки корму за температури 24 ºС протягом 5–7 діб. Ідентифікацію пліснявих грибів проводили методом MALDI-TOF. У процесі мікологічного обстеження кормів протягом 2018–2019 рр. було досліджено 198 зразків для тварин. За дослідний період найбільшу кількість обстежено комбікормів, що становило 30,4 % у 2018 році, від загальної кількості зразків (19,6 % – комбікорми для птиці, 10,8 % – для свиней). За п’ять місяців 2019 року спостерігаємо таку ж тенденцію: у 31,1 % випадків переважало визначення дріжджів та плісеневих грибів у комбікормах, із них 19,8 % припадає на комбікорми для птиці і у 11,3 % випадків – для свиней. На другому місці за кількістю досліджень зразки кукурудзи – 11,9 і 11,3 % у 2018 та 2019 рр. відповідно. Найбільш поширеними видами грибів у кормах були представники родів Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor, Rhizopus, Cladosporium. Належність мікроскопічних грибів до певних родів визначали шляхом оцінювання морфології колонії грибів на середовищах та морфологію конідієносних структур. Особливу увагу звертали на мікроскопічні гриби родини Fusarium, які є продуцентами різних мікотоксинів. За допомогою програмного забезпечення MALDI Biotyper проводили автоматичну ідентифікацію на підставі порівняння зібраних вихідних спектрів гриба із референтними спектрами бази даних самого приладу, а також із бібліотекою Бельгійського університету (BCCM, Belgian Co-Ordinateo collections of micro-organism). За результатами мас-спектрометрії, мікроскопічні гриби родини Fusarium були представлені 9 видами. Із них найчастіше зустрічали 5 видів: F. proliferatum, F. acutatum, F. subglutinans, F. verticillioides. Серед грибів родини Aspergillus переважали А. fl avus, A. pseudoglaucus, A. tubingensis, A. niger. Проведення видової ідентифікації мікроскопічних грибів за допомогою мас-спектрометрії допомагає швидко та якісно ідентифікувати плісняві гриби і дріжджі. Визначення видової належності мікроскопічних організмів відбувається за рахунок аналізу білкової фракції лізату мікроскопічних грибів та дріжджів (”пряме білкове профілювання“). Програмне забезпечення MALDI Biotyper включає автоматичну ідентифікацію пліснявих грибів на підставі порівняння вихідних спектрів з референтними спектрами бази даних. Ідентифікація мікроорганізмів за допомогою MALDI-TOF MS ґрунтується на оцінці рибосомних білків, які зазвичай наявні у клітині. Чутливість методу MALDI-TOF MS становить 103–106 м.к./см3. При цьому точність ідентифікації залежить від кількості досліджуваного матеріалу.

Для визначення ймовірності ідентифікації заданий логарифмічний показник – коефіцієнт відповідності Score, щодо значення якого оцінюють надійність і адекватність результатів. Чим вище коефіцієнт відповідності, тим імовірніше отримання правильного результату ідентифікації. Технологія МALDI-TOF мас-спектрометричної ідентифікації мікроміцетів характеризується високою швидкістю вимірювання, низькою вартістю використовуваних реактивів і матеріалів та простою пробопідготовкою.

Ключові слова: ідентифікація пліснявих грибів, MALDI-TOF, мас-спектрометрія, Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor, Rhizopus, Cladosporium.

1. Корноухова Л.Л. Результативность применения масс-спектрометрии при автоматизации микробиологической диагностики. Клин. лаб. диагностика. 2014. № 9. 73 с.

2. Sauer S., Kliem M. Mass spectrometry tools for the classifi cation and identifi cation of bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 2010. Vol. 8. P. 74–82.

3. Application and use of various mass spectrometry methods in clinical microbiology / S.Emonet, et al. Clin. Microbiol. Infect. 2010. Vol. 16. P. 1604–1613.

4. Полищук А.Г. MALDI-TOF масс-спектрометрическая идентификация медицински значимых микромицетов (обзор). Проблемы медицинской микологии, 2011. Т.13. №4. С. 8–10.

5. Identifi cation of dermatophyte species causing onychomycosis and tinea pedis by MALDI-TOF mass spectrometry / M. Erhard et al. Exp. Dermatol. 2008. Vol. 17. P. 356–361.

6. Rapid species diagnosis for invasive candidiasis using mass spectrometry / C. Marinach-Patrice et al. PLoS One. 2010. Vol. 5. 8862 p.

7. Real-time identifi cation of bacteria and Candida species in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of fl ight mass spectrometry / A. Ferroni et al. J. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48. P. 1542–1548.

8. Припутневич Т.В., Мелкумян А.Р. Масс-спектрометрия – новое слово в клинической микробиологии. Клиническая лабораторная диагностика. 2016. № 61(12). С. 842–848.

9. Improved identifi cation of yeast species directly from positive blood culture media by combining Sepsityper specimen processing and Microfl ex analysis with the matrixassisted laser desorption ionization Biotyper system / Y. Yan et al. J. Clin. Microbiol. 2011. Vol. 49. P. 2528–2532.

10. Matrix-assisted laser desorption ionization time-offl ight mass spectrometry for fast and accurate identifi cation of clinically relevant Aspergillus species / A. Alanio et al. Clin. Microbiol. Infect. 2011. Vol. 17. P. 750–755.

11. Use of mass spectrometry to identify clinical Fusarium isolates / C. Marinach-Patrice et al. Clin. Microbiol. Infect. 2009. Vol. 15. P. 634–642.

12. The use of ITS DNA sequence analysis and MALDITOF mass spectrometry in diagnosing an infection with Fusarium proliferatum / F. Seyfarth et al. Exp. Dermatol. 2008. Vol. 17. P. 965–971. 13. Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-fl ight (MALDI-TOF) mass spectrometry for identifi cation of Candida parapsilosis, C. orthopsilosis and C. metapsilosis / I.Quiles-Melero et al. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011. Vol. 12. P. 1364–1385.

14. Improved clinical laboratory identifi cation of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-fl ight mass spectrometry / O. Bader et al. Clin. Microbiol. Infect. 2011. Vol. 17. P. 1359–1365.

15. MALDI-TOF mass spectrometry proteomic phenotyping of dinically relevant fungi / L.Putignani et al. Mol. Biosyst. 2011. Vol. 7. P. 620–629.

16. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of fl ight mass spectrometry for identifi cation of clinically important yeast species / L. G. Stevenson et al. J. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48. P. 3482–3486.

17. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of fl ight mass spectrometry for fast and reliable identifi cation of clinical yeast isolates / G. Marklein et al. J. Clin. Microbiol. 2009. Vol. 47. P. 2912–2917.

18. Van Veen S.Q., Claas E.C.J., Kuijper Ed J. J. High-throughput identifi cation of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of fl ight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48. P. 900–907.

19. Geographic distribution and antifungal susceptibility of the newly described species Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis in comparison to the closely related species Candida parapsilosis / S. R. Lockhart et al. J. Clin. Microbiol. 2008. Vol. 46. P. 2659–2664.

20. Interaction of bacteria and ion-exchange particles and its potential in separation for matrixassisted laser desorption/ ionization mass spectrometric identifi cation of bacteria in water / Z. Guo et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009. Vol. 23. P. 3983–3993.

21. Whole-cell matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fl ight mass spectrometry for rapid identifi cation of bacteria cultured in liquid media / N. Zhou et al. Sci. China Life Sci. 2011. Vol. 54. P. 48–53.

22. Aspergillus PCR: One Step Closer to Standardization / P. L. White et al. J. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48. P. 1231– 1240.

23. Discrimination of Penicillium isolates by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-fl ight mass spectrometry fi ngerprinting / J. M. Hettick  et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008. Vol. 22. P. 2555–2560.

24. ДСТУ ISO 7954:2006 Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Загальні настанови з підрахунку дріжджів і мікроскопічних грибів. Техніка підрахунку колоній, культивованих за температури 25ºС (ISO 7954:1997, IDT). Київ: Держспоживстандарт України, 2008. 5 с.

25. Саттон Д., Фотергил А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. Москва: Мир, 2001. 467 с.

26. Аак О.В. Аллергены грибов, особенности микогенной сенсибилизации (Обзор). Пробл. мед. микологии. 2005. Т.7. № 2. С. 12–15.

27. Журавлева Н.П., Бегаева Н.Н., Бабенко Г.А. Естественная изменчивость микромицетов – продуцентов аллергено активных веществ.  Пробл. мед. микологии. 2001. Т.3. № 2. С. 3–5. 28. Тревор К. Шміт. Современные концепции микотоксикозов. Ефективне птахівництво та тваринництво. 2004. № 9. С. 67–73.

29. Ярошенко М.О. Плісеневі сапрофіти – біотичні контамінанти кормів як можливе джерело мікозів сільськогосподарської птиці. Ветеринарна медицина. 2016. В. 102. С. 235–240.

30. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М. Потенциальные патогенные мицелиальные грибы в среде обитания человека. Современные тенденции. Микология сегодня / под ред. Ю.Т. Дьякова, Ю.В. Сергеева. Москва: Национальная академия микологии, 2007. Т. 1. С. 235–266. 31. A dark strain in the Fusarium solani species complex isolated from primary subcutaneous sporotrichioid lesions associated with traumatic inoculation via a rose bush thorn / A.S. Kantarcioglu et al. Med. Mycol. 2009. Vol. 30. P. 1–7.

ДолученняРозмір
PDF icon tyshkivska_2_2019.pdf (28)3.57 МБ