Ви є тут

Ідентифікація бактерій роду Salmonella та сероварів Enteritidis і Typhimurium методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (ПЛР-РЧ)

У статті наведено результати ідентифікації бактерій роду Salmonella методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (ПЛР-РЧ). Було сконструйовано три пари фланкуючих праймерів та флуоресцентні зонди, які дозволяють одночасно ідентифікувати рід Salmonella, а також серовари Enteritidis та Typhimurium у полімеразній ланцюговій реакції в реальному часі. Оцінку специфічності набору праймерів проводили на штамах бактерій роду Salmonella різних сероварів Національного центру штамів мікроорганізмів (НЦШМ) Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ) та на 46 польових штамах роду Salmonella, що були ізольовані від птиці. Для перевірки специфічності праймерів  у якості гетерологічних зразків було використано штами E. Coli ATCC 25922, Bacillus cereus ATCC 11778, Listeria monocytogenes ATCC 19112 з колекції НЦШМ. Виділення ДНК бактерій проводили з використанням набору «ДНК-сорб Б» (Амплисенс), постановку реакції ПЛР в реальному часі виконували з реагентами «Набору для ПЛР-РЧ» (Синтол) на приладі Bio-rad CFX. Для оцінки чутливості праймерів було досліджено серію 10-кратних розведень ДНК S. Typhimurium та S. Enteritidis: 10-–10-. Встановлено, що аналітична чутливість праймерів для детекції роду Salmonella складає: для S. yphimurium – 0,25 нг/зразок (Typhimurium) та S. Enteritidis – 0,27 нг/зразок (Enteritidis). У результаті проведених досліджень підтверджено специфічність набору праймерів та високу чутливіть. Встановлено відсутність гібридизації праймерів зі зразками ДНК інших видів бактерій, зокрема, відмічено відсутність неспецифічних продуктів реакції. Також встановлено специфічність наборів праймерів для детекції ДНК сероварів Enteritidis та Typhimurium. За потреби дані набори праймерів можна використовувати для постановки мультиплексного варіанта ПЛР-РЧ, що дозволить одночасно ідентифікувати бактерії роду Salmonella та диференціювати серовари Enteritidis і Typhimurium.

Ключові слова: Salmonella, бактерії, полімеразна ланцюгова реакція, ДНК, ПЛР у режимі реального часу.

  1. Стегній Б.Т., Медвідь К.О., Музика Д.В., Рула О. М. Динаміка формування імунної відповіді у курей після щеплення інактивованою бівалентною вакциною проти сальмонельозу птиці. Ветеринарна біотехнологія. 2018. Вип. 32. N. 1. C. 265–271.
  2. Biofi lm formation by Salmonella sp. in the poultry industry: Detection, control and eradication strategies/ L. Merino et al. Food Research International. 2019. Vol. 119. No. July. C. 530–540. Doi: https://doi.org/10.1016/j. foodres.2017.11.024.
  3. Andreoletti O., Budka H., Buncic S. Quantitative estimation of the impact of setting a new target for the reduction of Salmonella in breeding hens of Gallus gallus. EFSA Journal. 2009. Vol. 7. No. 4. C. 1–68. Doi: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2009.1036.
  4. Инфекционные болезни животных / Бессарабов и др.; под ред. А. А. Сидорчука. Москва: КолосС, 2007. 671 с.
  5. Swayne D. E. Diseases of poultry, John Wiley & Sons, Inc. 2013. 1423 p.
  6. Інструкція з профілактики та ліквідації сальмонельозу птиці: Наказ Міністерства аграрної політики та продовольства України 19.09.2016 № 310. URL: https:// zakon.rada.gov.ua/rada/show/z1344-16.
  7. Prevention, detection and control of Salmonella in poultry / Terrestrial Animal Health Code. Paris. Offi  ce International des Epizooties (OIE). 2015.
  8. Rapid detection of Salmonella in poultry environmental samples using real-time PCR coupled with immunomagnetic separation and whole genome amplifi cation / J.Y. Hyeon et al. Poultry Science. 2019. Vol. 98. No. 12. P. 6973–6979. Doi:https://doi.org/10.3382/ps/pez425.
  9. Selenite enrichment broth to improve the sensitivity in molecular diagnostics of Salmonella/ M.D.  Boer et al. Journal of Microbiological Methods. 2019. Vol. 157. No. November 2018. P. 59–64. Doi:https://doi.org/10.1016/j. mimet.2018.12.018.
  10. Circulation dynamics of Salmonella enterica subsp. enterica ser. Gallinarum biovar Gallinarum in a poultry farm infested by Dermanyssus gallinae/ N. Pugliese et al. Medical and Veterinary Entomology. 2019. Vol. 33, No. 1. P. 162–170. Doi:https://doi.org/10.1111/mve.12333.
  11. Small non-coding RNA STnc640 regulates expression of fi mA fi mbrial gene and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis/ X. Meng et al. BMC veterinary research. 2019. Vol. 15. No. 1. 319 p. Doi:https://doi. org/10.1186/s12917-019-2066-7.
  12. Grimont P.A., Weill F.X. Antigenic formulae of the Salmonella serovars. Paris, France: WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. 2007.
  13. Salmonella bongori 48:z35:- In migratory birds, Italy/ M. Foti et al.  Emerging Infectious Diseases. 2009. Vol. 15, No. 3. P. 502–503. Doi:https://doi.org/10.3201/ eid1503.080039.
  14. Characterization of Antibiotic Resistant Salmonella spp Isolated from Chicken Eggs of Dhaka City/ M.M.  Ahmed et al. Journal of Scientifi c Research. 2010. Vol. 3. No. 1. 191 p. Doi:https://doi.org/10.3329/jsr.v3i1.6109.
  15. Shivaprasad, H. L. Fowl typhoid and pullorum disease. OIE Revue Scientifi que et Technique. 2000. Vol. 19. No. 2. P. 405–424. Doi:https://doi.org/10.20506/ rst.19.2.1222.
  16. Каришева, А. Ф. "Спеціальна епізоотологія: підручник." Київ: Вища освіта. 2002. 703 с.
  17. Поширення сальмонельозу тварин та птиці в Україні у 2015–2018 роках/ І.В. Галка та ін. Ветеринарна біотехнологія. 2019. Том. 35. C. 22–29. Doi:https://doi. org/10.31073/vet.
  18. Review of Salmonella detection and identifi cation methods: Aspects of rapid emergency response and food safety / K.M.  Lee et al. Food Control. 2015. Vol. 47. P. 264– 276. Doi:https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.07.011.
  19. Development of a multiplex real-time PCR method for simultaneous detection of Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in raw shrimp/ Z.  Zhang et al. Food Control. 2015. Vol. 51. P. 31–36. Doi:https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.11.007.
  20. Multiplex real-time PCR and culture methods for detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli and Salmonella Thompson in strawberries, a lettuce mix and basil/ S. Delbeke et al. International Journal of Food Microbiology. 2015. Vol. 193. P. 1–7.
  21. Jia Y. Chapter 3 – Real-Time PCR: Methods in Cell Biology. Elsevier, 2012. P. 55–68. Doi:https://doi. org/10.1016/B978-0-12-405914-6.00003-2.
  22. Transcriptional and translational control of the Salmonella fl iC gene/ P. Aldridge et al. Journal of Bacteriology. 2006. Vol. 188. No. 12. P. 4487–4496. https:// doi.org/10.1128/JB.00094-06.
  23. Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium by selective amplifi cation of fl iC, fl jB, iroB, invA, rfbJ, STM2755, STM4497 genes by polymerase chain reaction in a monoplex and multiplex format/ M.   Shanmugasundaram et al. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2009. Vol. 25. No. 8. P. 1385–1394. Doi:https://doi.org/10.1007/s11274-009-0025-3.
  24. Simultaneous Detection and Diff erentiation between Wild-Type and Vaccine Measles Viruses by a Multiplex RealTime Reverse Transcription-PCR Assay/ K. Pabbaraju et al. Journal of clinical microbiology. 2019. Vol. 57. No. 4. P. 1–9. Doi:https://doi.org/ 10.1128/JCM.01828-18.
  25. A TaqMan probe-based real-time PCR to diff erentiate porcine epidemic diarrhea virus virulent strains from attenuated vaccine strains/ J. Liu et al. Molecular and Cellular Probes. 2019. Vol. 45. No. April. P. 37–42. Doi:https://doi. org/10.1016/j.mcp.2019.04.003.
  26. Rukambile E., Alders R. Infection, colonization and shedding of Campylobacter and Salmonella in animals and their contribution to human disease : A review. 2019. No. June 2018. P. 1–17.
  27. The European Union summary report on trends and sources ofzoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2017EFSA and ECDC (European Food Safety Authority and European Centre forDisease Prevention and Control), 2018. EFSA Journal. 2018. Vol. 16(12):5500. 262 p. Doi:https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5500
ДолученняРозмір
PDF icon rublenko_1_2020.pdf (88)5.14 МБ