Ви є тут

Внутрішньолабораторна апробація протоколу ПЛР для молекулярно-генетичної ідентифікації бактерій роду Staphylococcus spp.

Наведені результати оптимізації протоколу ідентифікації бактерій Staphylococcus spp. методом полімеразної ланцюгової реакції з детекцією в агарозному гелі та апробації протоколу з польовими штамами відібраними від собак. Визначення параметрів специфічності та чутливості методу проводили на музейних штамах коків S. epidermidis АТСС 14990, S. aureus АТСС 25923, S. aureus subsp. aureus УКМ В-918, S. pneumoniae ATCC 49619 та E. faecalis ATCC 194433. Екстракцію ДНК проводили за допомогою набору IndiSpin Pathogen Kit. Для виготовлення реакційної суміші використали готовий ПЛР мікс NEB OneTaq® 2X Master Mix with Standard Buffer. Для дослідження використовували праймери націлені на ділянку гена tuf, що дають продукт ампліфікації 370 bp. Облік результатів реакції проводили в 2 % агаровому гелі з додаванням етидіум броміду у концентрації 0,5 %. Оптимальну температуру відпалу визначали методом градієнта температур. За дослідження специфічності методики три музейні штами стафілококів були ідентифіковані як позитивні, тимчасом штами інших коків не дали продуктів реакції. Дослідження чутливості методу полягало у виявленні продукту ампліфікації в семи розведеннях бактеріальної суспензії, що відповідають стандартам каламутності McFarland, найменша концентрації була додатково розведена у 10, 100 та 1000 разів. Останнє розведення, що показало наявність продукту ампліфікації відповідає 2×106 КУО в 200 мкл фізіологічного розчину, що використовували для виділення ДНК. Апробацію протоколу ПЛР проведено на польових штамах стафілококів. Для дослідження були відібрані вушні і назальні мазки у собак, а також змиви з клітки-переноски. Первинний посів матеріалу був проведений на маніт-сольовий агар, на цьому середовищі можливий ріст лише галофільних мікроорганізмів. Було виявлено ріст на 17 чашках Петрі. Дослідження змивів з цих чашок методом ПЛР вказало на наявність стафілококів у досліджуваних матеріалах. Результати внутрішньолабораторної апробації ПЛР вказують на те, що використаний нами праймер дає високі показники параметрів специфічності та чутливості. Апробована нами методика може бути використана для підтвердження наявності бактерій Staphylococcus spp. в первинному посіві мазків відібраних від собак.

Ключові слова: ПЛР, tuf ген, апробація праймерів, оптимізація праймерів, мікрофлора собак, Staphylococcus spp.

  1. Bertelloni F., Cagnoli G., Ebani V. V. Virulence and Antimicrobial Resistance in Canine Staphylococcus spp. Isolates. Microorganisms. 2021. Vol. 9. no. 3. 515 p. DOI:10.3390/microorganisms9030515
  2. Antimicrobial Resistance in ESKAPE Pathogens / D.M.P. De Oliveira et al. Clinical Microbiology Reviews. 2020. Vol. 33. no. 3. e00181-19. Doi:10.1128/ CMR.00181-19
  3. Гаркавенко Т. О., Козицька Т. Г. Механізм резистентності та методи виявлення метицилінрезистентного стафілокока (mrsa) (оглядова стаття). Ветеринарна біотехнологія. 2016. Т. 28. C. 42–54.
  4. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis/E. Tacconelli et al. The Lancet Infectious Diseases. 2018. Vol. 18. no. 3. P. 318–327. DOI:10.1016/S1473-3099(17)30753-3
  5. Systematic review and meta-analysis of the occurrence of eskape bacteria group in dogs, and the related zoonotic risk in animal-assisted therapy, and in animal-assisted activity in the health context / A. Santaniello et al. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2020. Vol. 17. no. 9. DOI:10.3390/ijerph17093278
  6. Direct detection of methicillin-resistant in Staphylococcus spp. in positive blood culture by isothermal recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick assay / A. Srisrattakarn et al. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2020. Vol. 36. no. 11. 162 p. DOI:10.1007/s11274-020-02938-8
  7. Molecular Detection and Characterization of the mecA and nuc Genes From Staphylococcus Species (S. aureus, S. pseudintermedius, and S. schleiferi) Isolated From Dogs Suffering Superficial Pyoderma and Their Antimicrobial Resistance Profiles / M. S. González-Domínguez et al. Frontiers in Veterinary Science. 2020. Vol. 7. no. July. P. 1–11. DOI:10.3389/fvets.2020.00376
  8. Velizarova Rusenova N., Georgiev Rusenov A. Detection of staphylococcus aureus among coagulase positive staphylococci from animal origin based on conventional and molecular methods. Macedonian Veterinary Review. 2017. Vol. 40. no. 1. P. 29–36. DOI:10.1515/macvetrev-2016-0095
  9. Балбутская А. А., Дмитренко О. А., Скворцов В. Н. Современные особенности видовой идентификации коагулазоположительных бактерий рода Staphylococcus. Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62. № 8. C. 497–502. DOI:10.18821/0869-2084-2017-62-8-497-502
  10. Efficacy of MALDI-TOF mass spectrometry as well as genotypic and phenotypic methods in identification of staphylococci other thanStaphylococcus aureus isolated from intramammary infections in dairy cows in Poland/A. Wanecka et al. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2019. Vol. 31. no. 4. P. 523– 530. DOI:10.1177/1040638719845423
  11. Multiplex-PCR method for species identification of coagulase-positive staphylococci/T. Sasaki et al. Journal of Clinical Microbiology. 2010. Vol. 48. no. 3. P. 765–769. DOI:10.1128/JCM.01232-09
  12. Development of a PCR Assay for Identification of Staphylococci at Genus and Species Levels / F. Martineau et al. Journal of Clinical Microbiology. 2001. Vol. 39. no. 7. P. 2541–2547. DOI:10.1128/ JCM.39.7.2541-2547.2001
  13. PCR Detection of Bacillus and Staphylococcus in Various Foods/S. Nakano et al. Journal of Food Protection. 2004. Vol. 67. no. 6. P. 1271–1277. DOI:10.4315/0362-028X-67.6.1271
  14. Identification of Staphylococcus spp. by PCRRestriction fragment length polymorphism of gap gene/J. Yugueros et al. Journal of Clinical Microbiology. 2001. Vol. 39. no. 10. P. 3693–3695. DOI:10.1128/ JCM.39.10.3693-3695.2001
  15. Species-level identification of clinical staphylococcal isolates based on polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of a partial groEL gene sequence / E. M. Barros et al. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2007. Vol. 59. no. 3. P. 251–257. DOI:10.1016/j. diagmicrobio.2007.05.004
  16. Alarcón B., Vicedo B., Aznar R. PCRbased procedures for detection and quantification of Staphylococcus aureus and their application in food. Journal of Applied Microbiology. 2006. Vol. 100. no. 2. P. 352–364. DOI:10.1111/j.1365-2672.2005.02768.x
  17. Kilic A., Basustaoglu A. C. Double triplex real-time PCR assay for simultaneous detection of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, and Staphylococcus haemolyticus and determination of their methicillin resistance directly from positive blood culture bottles. Research in Microbiology. 2011. Vol. 162. no. 10. P. 1060–1066. DOI:10.1016/j.resmic. 2011.07.009
  18. Tagini F., Greub G. Bacterial genome sequencing in clinical microbiology: a pathogen-oriented review. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2017. Vol. 36. no. 11. P. 2007– 2020. DOI:10.1007/s10096-017-3024-6
  19. Внутрішньолабораторна апробація праймерів для молекулярно-генетичної ідентифікації грибів роду Fusarium link/В. Д. Іщенко та ін. Наукові доповіді Націоналного університету біоресурсів і природокористування України 2019. № 6(82). DOI:10.31548/dopovidi 2019.06.017
  20. Morot-Bizot S. C., Talon R., Leroy S. Development of a multiplex PCR for the identification of Staphylococcus genus and four staphylococcal species isolated from food. Journal of Applied Microbiology. 2004. Vol. 97. no. 5. P. 1087–1094. DOI:10.1111/ j.1365-2672.2004.02399.x
ДолученняРозмір
PDF icon shevchenko_1_2022.pdf899.72 КБ